不管是被称为历史重大传染疾病的鼠疫、肺结核、霍乱,还是我们日常生活中常见的皮肤疾病,都对公共卫生和经济构成挑战。快速鉴别病原体鉴定抗生素敏感性是应对这一危机的2项关键任务。当下虽有各样的监测方法和系统,但是在效率、经济、操作上却不能同时具备。

波士顿大学的程继新教授与普渡大学的梅建国教授团队合作报道了一种水溶性电制变色的聚(3,4-丙二氧基噻吩-alt-3,4-亚乙基二氧基噻吩)共聚物(PPE)作为新型代谢活性细菌传感器,当与活菌混合后,可在30分钟内表现出明显的比色和光谱变化,对革兰氏阴性菌和阳性菌具有鉴别能力,区分耐药菌和敏感菌,以及对不同抗生素的敏感性评价都有出色的效果;并且,用于生物应用的聚合物电制变色的研究仍处于起步阶段,该报道可谓是做出了巨大的进展。相关成果以“Polymer Electrochromism Driven by Metabolic Activity Facilitates Rapid and Facile Bacterial Detection and Susceptibility Evaluation”为题于2020年9月13日发表于《Advanced Functional Materials》杂志。

波士顿大学程继新/普渡大学梅建国《AFM》:聚合物电致变色新应用,检测细菌并评估其敏感性

[目前病原菌鉴定和药敏试验技术的不足]

传统技术费时费力,导致患者治疗延误,严重感染的风险高。虽然聚合酶链反应(PCR)和质谱(MS)法可以实现特异性的分析,并将检测时间缩短到几个小时,但它们需要大量的数据库,并且缺乏直接检测活菌功能的能力;近年来,分子传感器已被用于微生物传感,许多微生物传感器基于抗体抗原识别或其他特定的配体-受体相互作用,其使用仅限于某些特定的环境,不能用于未知病原体;此外,通过阳离子聚合物监测荧光变化来鉴别细菌,但是无法区分活菌和死菌,并且一些物质对细胞有很高的毒性;最近,通过点击反应感知细菌代谢已被证实,但是这种共价结合可能会扰乱细菌结构和功能,以至于不能准确进行判断。

[PPE/ox-PPE的电致变色性能]

电致变色通常被定义为电活性材料在化学或电化学掺杂过程中发生可逆的颜色变化,可以通过添加化学掺杂剂(还原剂/氧化剂)或施加适当的电压来实现。PPE的颜色可以通过电化学反应进行调节(图1a);如图1b所示,在电化学氧化后,PPE膜从可见区域的蓝色状态转换到近红外区域的漂白状态;并且该共聚物氧化电位很低,水溶液中的PPE可直接被环境氧化并大部分转化为双极性(图1c),天然氧化的PPE(ox-PPE)在水溶液中具有高稳定性,因此可避免使用任何有毒氧化剂以降低对哺乳动物细胞的细胞毒性。

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图1 PPE / ox-PPE的电致变色性能

[细菌驱动的电致变色机理研究]

为了弄清ox-PPE的变化是否由细菌的代谢活动介导,以葡萄糖为例,文章进行了葡萄糖依赖性和温度依赖性的测量。图2a显示,ox-PPE的还原水平与葡萄糖浓度有很强的相关性,表明反应是由葡萄糖依赖的代谢过程驱动的;此外,当代谢活性在低温(4℃)下受到抑制时,ox-PPE的还原也随之减少(图2b)。因此,ox-PPE的减少是由代谢活性细菌介导,由此证明ox-PPE能够区分活菌和死菌,并可用于检测生长缓慢的细菌。通过后续研究,发现培养时间和反应水平之间呈正相关(图2c);当添加无细胞上清液会激发ox-PPE的还原活性,如图2d显示,半胱氨酸和GSH诱导ox-PPE明显还原,而其他还原分子与ox-PPE的相互作用较小,因此,ox-PPE的减少可能是由半胱氨酸和GSH等细胞外代谢控制。

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图2 ox-PPE对大肠杆菌的比色反应

[聚合物PPE性能测试]

ox-PPE对细菌的比色反应

研究人员将PPE与大肠杆菌共同培养,发现在短时间内(30分钟)发生了明显的显色变化(图3a),并且具有时间依赖性和浓度依赖性(图3c-f),表明ox-PPE可被用作微生物探针。

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图3 ox-PPE对大肠杆菌的比色反应

革兰氏阴性菌与阳性菌的检测与鉴别

研究人员用3株革兰氏阳性菌与5株革兰氏阴性菌验证还原反应的普遍性,30分钟后发现ox-PPE光谱发生变化,并且革兰氏阴性菌与阳性菌在700~900nm窗口的光谱存在一定的差异;图4b所示的PCA结果表明,ox-PPE可在30分钟内鉴别出革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。

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图4 ox-PPE对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株的区分

抗生素敏感性快速检测

抗生素的攻击会导致细菌转录谱发生迅速而巨大的变化,从而导致蛋白质合成和代谢活性的下降。这种与即时细胞反应相关的代谢休克可以用来探测细菌对抗生素的敏感性。研究人员对环丙沙星(CIP)、氧氟沙星(OFL)、多粘菌素B(PMB)、四环素(TET)、红霉素(ERY)、苯唑西林(OXA)等不同抗生素的疗效进行定量分析,发现ox-PPE可以快速、高通量地评估抗生素对不同抗生素的敏感性。

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图5 大肠杆菌对不同抗生素的抗药性

[小结]

本文介绍了一种快速、简便、高通量的水溶性电制变色ox-PPE,以用于细菌检测、鉴别和敏感性检测。使得细菌检测、革兰氏阴性菌和阳性菌的鉴别以及抗菌药物敏感性试验成为可能;同时,该成果也为用于生物应用的聚合物电致变色研究迈出巨大一步、为传染病的个性化诊断和处方提供了巨大的前景。

全文链接:

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/adfm.202005192

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