水凝胶是由物理或化学交联的水溶胀性聚合物网络合成的软材料。由于其出色的生物相容性/生物降解性,与天然组织和器官相似的机械性能以及对环境的响应能力,水凝胶已被广泛用于生物医学应用,包括药物输送、生物传感器、组织工程和再生医学的合成细胞外基质(ECM)。最近,许多生物分子,包括蛋白质、肽、DNA和RNA被用作合成水凝胶的结构单元。蛋白质水凝胶因其可设计和可调节的生化及机械特性而倍受关注。南京大学的曹毅团队在 ACS Macro Lett.上发表了“100th Anniversary of Macromolecular Science Viewpoint: Synthetic Protein Hydrogels”,以高分子科学的观点综述了合成蛋白水凝胶的最新进展。

​南京大学曹毅团队: 合成蛋白水凝胶的最新进展

1. 从天然蛋白质到合成蛋白质/肽

天然蛋白质可从自然界获得,已广泛用于水凝胶。

例如,基质胶是多种结构的混合物蛋白质(包括层粘连蛋白、胶原蛋白和蛋白聚糖);来自单一蛋白成分的其他天然蛋白水凝胶(包括弹性蛋白、胶原蛋白、明胶(部分变性的胶原蛋白)、丝蛋白和球状蛋白)。除了天然来源,蛋白质还可通过重组DNA技术和固相肽合成方法获得。

蛋白质水凝胶可以完全由合成蛋白质制成,也可以由蛋白质和其他聚合物的混合网络制成。

蛋白水凝胶的优点是合成步骤简单,网络结构相对更均一。与化学合成或天然衍生的聚合物相比,重组蛋白通常更昂贵。

全蛋白质和杂合蛋白质水凝胶都可以是动态物理凝胶或稳定的化学凝胶。在水凝胶网络中,蛋白质既可以充当交联剂,也可以充当承重模块。

 

2. 蛋白质水凝胶的独特性

与其他聚合物相比,蛋白质许多特性使蛋白质水凝胶具有多种功能。

蛋白质是具有明确定义的序列的聚合物,其分子水平上的化学性质(交联密度和生物活性配体的数量)能够很好被地控制。

其次,蛋白质一级序列编码的独特二级和三级结构使其有不同的机械性能。此外,自然界为水凝胶提供了丰富的蛋白质构件。

它们可以是来源于具有机械特性的结构蛋白,也可以是体内无机械功能的蛋白质。大多数蛋白质具有生物相容性,适合生物医学应用。

 

3. 蛋白质模块的结构和机械性能

水凝胶的机械性能是调节细胞增殖、扩散和分化的重要生理信号。细胞可以感知并响应水凝胶的多种复杂机械性能,包括弹性、韧性、应变软化/刚度和应力松弛。这些蛋白质可以是生物环境中具有明确机械功能的天然蛋白质,也可以是不具有机械功能的蛋白质(图1)。

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图1. 合成蛋白水凝胶中使用的代表性蛋白构件。

弹性蛋白和节肢弹性蛋白是随机线圈结构,并在体内起熵弹簧的作用。

它们与组织的弹性和可延展性相关,这些蛋白质可以使用重组DNA技术合成。

这些蛋白质的拉伸和松弛曲线是可逆的,无滞后现象。

弹性蛋白通常是高度水溶性的,化学交联可形成水凝胶。弹性蛋白的可溶性及溶解度取决于它们的序列。

许多天然弹性蛋白是纤维状的,但纤维状结构的合成蛋白非常有限。与内在无序的蛋白质和纤维状蛋白质相比,球状蛋白质在性质上更为丰富,是天然细胞外基质的主要成分。

它们可以通过机械力展开,从而为材料提供可扩展性和韧性。

将不同的球状蛋白结合起来可设计机械性能(包括弹性,韧性,可延展性和自愈性能)可调控的蛋白水凝胶。通过调节交联剂和承载模块的机械性能可半定量预测工程化水凝胶的机械性能。

 

4.化学交联方法:

在水凝胶中,永久性共价交联提供水凝胶所需的机械刚性,而物理交联提供水凝胶的动态和响应特性(图2A)。

理想的交联方法是专一、快速、高产率的。通常这些交联方法基于蛋白质酪氨酸、半胱氨酸和赖氨酸(图2B)。

交联方法包括光催化、酶催化、被氧化形成二硫键、巯基Michael加成与缺电子碳-碳双键或自由基巯基烯与缺电子碳-碳双键的反应。

这些反应并被用于设计蛋白质-聚合物杂化水凝胶。水凝胶也可以利用许多酶催化反应进行工程设计(图2C)。

通常使用的连接酶包括sortase、裂肠肽、丁烯醛、磷酸泛乙烯基转移酶和天冬酰胺基内肽酶。

它们可以连接特定的肽序列或肽配体形成共价键。这些酶促反应具有特异性和正交性。

当不同的酶被结合时,它们可用于复杂结构的水凝胶工程。

酶的浓度和活性可控制凝胶动力学,为控制凝胶动力学提供途径。

其他一些能够改变蛋白质疏水性或构象的酶也可以用来启动蛋白质水凝胶的凝胶化,如基因编码的点击化学(图2D)。

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图2. 制备蛋白质水凝胶的化学交联方法。(A)化学交联方案。(B)酪氨酸、赖氨酸和半胱氨酸的典型化学交联反应。(C)Sortase催化的肽连接构建蛋白质网络。(D)基因编码的SNAP-tag/BG和SpyCatcher/tag制备水凝胶。

 

5.物理交联方法:

水凝胶也可以基于蛋白质-蛋白质或蛋白质-配体相互作用进行物理交联。据估计,在人类相互作用体中存在∼650 000蛋白质-蛋白质相互作用。

然而,可用于交联蛋白质水凝胶的相互作用对应满足以下要求:

  • 1,交互对不应该太大,否则它们可能会影响在细菌中的溶解度和表达;
  • 2,应具有较强的亲和力;
  • 3,绑定/解除绑定动力学也很重要。

水凝胶应具有良好的自愈性和注入性。然而,如果相互作用过于动态,水凝胶往往是不稳定。

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图3. 几种构建水凝胶的蛋白质-蛋白质/蛋白质-配体相互作用,包括螺旋线圈、WW结构域和二聚结构域。

 

6.刺激响应性:

许多蛋白质在体内负责信号转导和能量转换,这些功能往往是通过蛋白质的动态构象变化来实现的。

这种独特的特性可以直接实现到蛋白质水凝胶中,以获得刺激响应性。蛋白质水凝胶可以通过配体结合诱导蛋白质构象变化来响应不同的化学物质。蛋白质水凝胶可以通过化学变性剂和热诱导的蛋白质折叠/展开来响应外界刺激,但化学变性剂会破坏蛋白质的稳定性,甚至导致蛋白质的去折叠,大大降低水凝胶的机械强度;温度也有导致蛋白质的不可逆热变性和聚集的缺点,尽管设计得当时可用于生产强韧蛋白质水凝胶。

pH和盐离子响应性水凝胶也可以基于肽和蛋白质的折叠/展开进行工程设计。

光响应蛋白质水凝胶具有特殊的意义,它们可以无创、可逆地控制溶胶-凝胶转变并在时空尺度上调节机械性能,许多光响应蛋白已被设计成响应水凝胶(图4)。

光响应蛋白水凝胶可以通过三种不同方法工程化:

  • (1)光诱导蛋白质低聚物的离解/缔合;
  • (2)蛋白质的光解;
  • (3)蛋白质的构象变化。

其他响应性水凝胶也被广泛研究。如酶反应水凝胶可用于药物控制释放和细胞培养。

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图4. 光响应蛋白质。

7.网络结构:

水凝胶的稳定性和力学性能与其网络结构直接相关,水凝胶网络决定外力如何传递到单个蛋白质。

尽管大多数合成蛋白质是线性聚合物,但仍有很大空间改变网络结构(图5)。

蛋白质及蛋白质-蛋白质复合物的机械稳定性在很大程度上取决于拉力的方向。

蛋白质水凝胶中的蛋白质通常从其两端承受拉伸力,但一些交联方法随机合成的水凝胶网络拉伸方向不明确。

利用蛋白质工程技术可以明确蛋白质上的力方向,这对于物理交联水凝胶尤为重要。

引入多臂交联剂可以构建具有理想网络结构的蛋白质水凝胶。具有新拓扑结构的蛋白质水凝胶的网络由于精确的序列接近理想的网络拓扑结构。

因此,多臂蛋白水凝胶的缺陷更小,力学稳定性更强。

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8.生物医学应用:

蛋白质水凝胶的许多特性使其成为生物医学应用的理想软材料。

首先,它们可以使用细胞外基质的蛋白质构建为基础,因而具有细胞相容性高,适用于多种细胞培养和体内应用。

水凝胶物理/化学性质对其他生物应用也很重要。

例如,在三维细胞培养时,溶胶-凝胶转变速度应非常快,以避免细胞在包裹过程中沉淀;蛋白质水凝胶的力学性质可以作为一种控制细胞自我更新、增殖、迁移和干细胞分化的新手段;当使用合成蛋白质水凝胶进行蛋白质和细胞传递时,剪切稀释和自愈性能对治疗药物的注射性是必不可少的。

【结论和展望】

尽管合成蛋白水凝胶在软生物材料领域中已经取得了很大的进步,但其工程设计仍然存在许多挑战。

首先,合成蛋白的稳定性和产量难以提高合,成本降低困难。

其次,仍然很难用排列良好的纤维来复制自然组织的各向异性结构。

第三,需要系统研究来合理设计蛋白质水凝胶的机械性能。

第四,一旦将细胞培养在蛋白质水凝胶中,集成的系统便具有协同的机械性能。

此外,细胞培养过程中的动态响应会改变蛋白质水凝胶机械性能。

最后,尽管大多数蛋白质直接来自天然人类蛋白质,但其生物相容性应进一步被研究。

基于蛋白质水凝胶的独特特征和该研究领域的迅速扩展,作者认为蛋白质水凝胶在未来有更广泛的生物医学应用。

一些成熟的蛋白质水凝胶可以作为实验室细胞培养的标准材料,甚至可以作为医学和临床应用的新型生物材料进行商业化。

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