高效口服胰岛素问世,两性胶束递送胰岛素无需打开紧密连接

相比起用定期针头注射胰岛素治疗糖尿病患者,口服蛋白药物被认为是有效解决方案。口服蛋白质制剂的临床转化由于药物不能有效地穿过肠粘液和上皮细胞层而受到阻碍,这导致其吸收和生物利用度低,且打开紧密连接(紧密连接:又称闭锁小带,相邻细胞膜共同构成的一个事实上液体无法穿透的屏障。是两个细胞间紧密相连的区域。它是一类只在脊椎动物中出现的细胞连接复合物)会引起安全问题。

近日,Nature Nanotechnology刊登了由美国韦恩州立大学华人学者曹智强副教授团队的最新成果。他们报告的两性离子胶束有望解决上述问题,该胶束具有模拟病毒的两性离子表面,甜菜碱侧链和超低的临界胶束浓度,能够使药物通过粘液渗透,并通过转运蛋白的上皮有效吸收,而无需打开紧密连接。

亮点:

1. 该胶束平台通过将两性离子胶束胰岛素的冷冻干燥粉末封装到肠溶衣胶囊中而用于制备口服胰岛素原型样本。

2. 生物相容性口服胰岛素具有高达 40%的高口服生物利用度,提供了微调胰岛素作用模式的可能性,以及长期安全性,从而可以通过口服方式递送蛋白质药物。

美国韦恩州立大学曹智强《Nat.Nanotech.》:高效口服胰岛素问世,两性胶束递送胰岛素无需打开紧密连接

【图文解析】

作者使用两性甜菜碱聚合物胶束(DSPE-PCB)来模拟衣壳病毒的表面特征(图1a),并封装模型蛋白胰岛素。聚羧酸甜莱碱(PCB)通过质子辅助氨基酸转运蛋白1(PAT1)穿透上皮细胞层(图1b)。PAT1可以促进甜菜碱和甜菜碱衍生物渗透到上皮细胞层。

两性离子胶束DSPE-PCB的一项主要优势是其超低临界胶束浓度(CMC)低于10-6 mM。与CMC值高几个数量级的普通表面活性剂相比,这意味着DSPE-PCB分解并在紧密连接蛋白和细胞膜上发挥去污垢作用的可能性很小。经乳果糖-甘露醇肠道通透性测试和透射电子显微镜(TEM)表征,DSPE-PCB处理的上皮组织未显示任何闭锁小带打开(图1c)。

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图1. 用于口服胰岛素的DSPE-PCB胶束的示意图。a – c,DSPE-PCB胶束平台可解决粘液(a)和上皮细胞层(b)的障碍,而无需打开紧密连接(c),从而有助于总体上增强肠道吸收。 两性离子颗粒增加了通过粘液的转运

 

作者构建了由两性单体和其他中性,带正电和带负电的单体与荧光交联剂交联而成的纳米凝胶颗粒(图2a)。

尽管这些纳米凝胶颗粒粒径约40 nm,但他们ζ电势明显不同(图2b)。

将这些颗粒与猪的胃粘液温育,并在共聚焦荧光显微镜下追踪其扩散轨迹。

两性PCB颗粒的整体平均几何均方位移(MSD)约为PEG颗粒的6.7倍,是阴离子和阳离子颗粒的100倍甚至更多倍(图2c))。

这些结果表明,两性颗粒在粘液中的扩散速度比现有技术中穿透粘液的PEG颗粒快得多。

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图2. 与包括基于PEG的粒子在内的其他粒子相比。a,不同纳米凝胶颗粒的单体和交联剂结构。b,DLS和Zeta电位。c,纳米凝胶在猪胃粘液中运输。d,DSPE-PCB和聚山梨酯80胶束的结构。e,封装了荧光有效负载的胶束的DLS数据和zeta电位。f,胶束样品在猪胃粘液中的运输。

 

两性离子胶束通过转运蛋白增加吸收

两性离子DSPE-PCB用于通过简单过程封装人类重组胰岛素,在存在DSPE-PCB和胰岛素的情况下,缓慢添加Zn2+,这会导致胰岛素沉淀和胶束封装。DSPE-PCB /胰岛素和聚山梨酯80 /胰岛素的尺寸低于30 nm(图3a,b)。经发现,DSPE-PCB输送注射入糖尿病小鼠的胰岛素有效的降低了小鼠血糖水平(图3c)。为了研究DSPE-PCB胶束穿过上皮层的潜在途径,将金纳米颗粒封装其内 。注射后1小时, TEM图表明位于上皮细胞内部的金纳米颗粒证明的转运蛋白介导途径(图3d)。

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图3. 两性离子胶束/胰岛素:表征,高肠吸收功效和转运蛋白介导的吸收机制。a,DSPE-PCB /胰岛素的TEM图像。b,DLS数据。c,对糖尿病小鼠的降血糖(药理)性能比较。d,回肠注射DSPE-PCB /金纳米颗粒1小时后上皮组织的TEM图像

 

进一步共聚焦激光扫描显微镜和流式细胞术对DSPE-PCB /荧光标记的聚苯乙烯纳米颗粒进行了体外细胞吸收研究。与常规3T3细胞相比,在Caco-2细胞上观察到了DSPE-PCB胶束颗粒的明显更高水平的细胞摄取(图4 a–c)。甜菜碱或L-色氨酸明显抑制了Caco-2这种高水平细胞摄取(图4 a–c)。聚山梨酯80用作非靶向对照,未发现Caco-2细胞可观察到的聚山梨酯80吸收(图4 d)。

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图4. 共聚焦激光扫描显微镜图像(a),两性离子DSPE-PCB和聚山梨酯80荧光标记聚苯乙烯纳米颗粒共孵育(b)和流式细胞数(c)。用DSPE-PCB /荧光标记的聚苯乙烯纳米颗粒(网格单位长度= 20 µm;红色,细胞膜;绿色,聚苯乙烯纳米颗粒;蓝色,细胞核)孵育的Caco-2细胞的三维可视化(d)。

 

上皮穿透而不打开紧密连接

作者接着将乳果糖,甘露醇和游离胶束共同通过回肠注射给健康和糖尿病小鼠。其中采用液相色谱/串联质谱法(LC-MS-MS)对乳果糖和甘露醇含量进行定量(图5a,b)。紧密连接打开允许更多的乳果糖(比甘露醇大)通过,并总体上增加了排泄的L / M比。与此相反,聚山梨醇酯80和癸酸钠两治疗组显示较高的L / M比值。经DSPE-PCB胶束处理的组织显示出完整的紧密连接,其形态与未经任何胶束处理的对照组织相似(图5c)。

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图5. 两性离子胶束/胰岛素处理未打开肠道闭锁小带。a,b,对糖尿病(a)和健康(b)小鼠的肠通透性测试。c,回肠注射不同类型的表面活性剂后1小时,上皮组织的代表性TEM图像。闭锁小带用箭头指示。

 

口服胰岛素原型样本的开发

通过将直接冻干的DSPE-PCB /胰岛素粉末包装到M号猪明胶胶囊中,然后进行Eudragit L100-55肠溶包衣程序。基于降糖曲线(图7a),经计算DSPE-PCB /胰岛素胶囊的药理活性为43.4%,远高于聚山梨酯80 /胰岛素胶囊的8.56%。根据血清胰岛素曲线(图7b),DSPE-PCB /胰岛素胶囊的生物利用度计算为42.6%,而聚山梨酯80 /胰岛素仅为8.35%。通过改变原型样本配方中使用的Zn2+的组成,研究了降低血糖水平的可行性,和食物对DSPE-PCB /胰岛素胶囊的潜在作用(图7c和d)。在离体荧光成像研究中,进一步检查了口服后不同时间点口服胰岛素的吸收部位(图7e)。

美国韦恩州立大学曹智强《Nat.Nanotech.》:高效口服胰岛素问世,两性胶束递送胰岛素无需打开紧密连接
图7. 含有两性胶束/胰岛素的口服胰岛素胶囊的药理活性和生物利用度,以及调节药物作用能力的曲线。

 

【陈述总结】

总而言之,该文显示了两性胶束平台(DSPE-PCB)能够同时解决粘液和上皮屏障的障碍,并大大增强了蛋白质有效载荷(胰岛素)在肠道的转运。通过将DSPE-PCB /胰岛素的干粉包装到肠溶胶囊中,可以轻松制造口服胰岛素原型样本。与其他临床前口服胰岛素不同,该制剂利用PAT1作为上皮渗透的机制,在微调药物作用过程中实现了高生物利用度和可控制的多功能性,并且不会引起紧密连接打开。

作者简介

曹智强,2000-2007年获天津大学高分子材料与工程学士学位和生物医学工程硕士学位, 2011年获华盛顿大学化学工程博士学位,师从华盛顿大学华人教授江绍毅。

曾在麻省理工学院David H. Koch综合癌症研究所Robert Langer的实验室,及波士顿儿童医院和哈佛医学院麻醉学部任研究员。

现任韦恩州立大学化学工程与材料科学学院副教授。主要研究方向为新材料及其在医疗和生物医学工程中的转化应用。

他的研究由国家科学基金会(NSF),美国国家卫生研究院(NIH)和青少年糖尿病研究基金会(JDRF)等多项计划支持。并获得2016年NIH NIDDK 1型糖尿病探路者奖(DP2)。

 

全文链接:

https://doi.org/10.1038/s41565-020-0693-6

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