通过3D生物打印技术,科学家们已经可以在体外得到各种人体器官和组织工程支架。但是想要把它们植入人体中,让它们发挥应用的作用,就必须要对患者进行手术,暴露目标部位。然而手术总是会给患者带来不同程度的伤口,甚至对患者造成二次伤害,这与当今临床医学的发展理念背道而驰。医生和患者都希望尽可能地减少手术带来的伤口和痛苦,因而医学界急需一种无创3D生物打印技术。

基于数字化光处理(DLP)的3D生物打印技术具有生物相容性好、高细胞活性、打印精度高、打印速快的优点。但是传统的DLP 3D生物打印技术都是基于紫外或蓝光引发的光聚合反应开发的,这使其皮肤透过性较差,无法直接引发皮肤下的单体聚合。虽然目前可以通过混合上转换纳米粒子(UCNP)和紫外光活性的光引发剂实现近红外光引发聚合,但是裸露的UCNP会造成紫外光泄露,降低引发速率并对人体造成伤害。

近日,四川大学生物治疗国家重点实验室的苟马玲研究员、钱志勇教授和魏霞蔚教授团队在无创3D生物打印技术上做出了开创性的贡献。

其核心为核壳结构的近红外活性光引发纳米粒子(UCNP@LAP),通过将紫外光活性的光引发剂苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP)静电吸附在UCNP表面而非简单混合,研究团队大大降低了此类引发剂的紫外光泄露,在提高了光利用率的同时,还保证了引发剂的生物安全性。基于这种纳米光引发剂,研究团队开发了数字近红外生物打印技术(DNP),通过连接有数控微镜装置(DMD)的3D生物打印平台,红外光被引向注射了单体、细胞和纳米光引发剂的皮下组织,从而实现皮下3D原位生物打印。

四川大学《Science》子刊:直接在体内进行无创3D打印!
无创3D生物打印平台

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图 1 基于DNP的无创3D生物打印平台示意图

 

无创3D生物打印的基本流程如图1所示。3D生物打印的原材料(纳米光引发剂、单体和组织细胞)通过注射的方式固定在目标位置,DMD系统在接收到来自控制台的CAD设计图后,对近红外光进行调制,然后投射到对应的皮下组织内,激活纳米光引发剂,从而实现原位无创聚合。基于纳米光引发剂的上转换特性,传统的生物相容性水凝胶单体都可通过近红外光照射引发聚合。

纳米光引发剂的表征及聚合活性

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图 2 纳米光引发剂UCNP@LAP的表征

 

傅里叶红外光谱(FTIR)、透射电子显微镜(TEM)和能量色散X射线光谱(EDX)分析结果表明LAP成功吸附在UCNP表面(图2A、B),热重分析结果表明LAP的负载量为12 wt%(图2C)。通过对比LAP的吸收光谱和UCNP的上转换发光光谱可以发现在980 nm近红外光激发下,UNCP的紫外释放峰值(320和380 nm)与LAP的紫外吸收区域有较好的重叠,并且UCNP@LAP的紫外释放消失,证明该引发剂在近红外光下具有良好的光吸收效率(图2D)。将不同浓度的纳米光引发剂UCNP@LAP(0.5、1、2 wt%)用于15 wt%的甲基丙烯酰化明胶(GelMA)的聚合反应的实验结果表明提高引发剂浓度、延长聚合时间以及增加红外光功率均可提高单体的反应程度(图2E、F)。

DNP技术用于3D生物打印的可行性

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图 3 使用DNP技术在体外3D打印无细胞结构

 

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图 4 使用DNP技术在体内3D打印无细胞结构

 

为论证基于纳米光引发剂构建的DNP技术用于无创3D生物打印的可行性,研究人员首先在体外用常用的生物材料GelMA为打印墨水,以逐层打印的方式打印了多种不包含细胞的微结构(图3A)。为进一步模拟在体内打印的情况,研究人员又将老鼠皮肤或猪的肌肉组织覆盖在生物墨水上,再进行打印(图3C)。试验结果表明组织下打印结构完整,形状误差控制在12.1%。最后,研究人员将不包含细胞的生物墨水注射到BALB/c小鼠皮下,进行了体内实验(图4)。在打印1天及7天后,打印结构及周围的组织仍保持完整,并且没有显示出明显的副作用,证明了DNP技术的3D无创打印具有应用于临床治疗的潜力。

基于DNP的非侵入式体内原位打印

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图 5 采用DNP技术在体内无创3D打印类耳组织

 

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图 6 采用无创3D生物打印脂肪干细胞(ASC)骨架用以修复受损的肌肉组织

 

由先天畸形或外伤导致的耳廓缺损对患者的生理和心理有严重伤害。此类先天畸形在全球范围内的发病率约为万分之0.83 – 17.4,并且亚洲人发病率更高。这一疾病的治疗手段包含了人造耳廓的体内移植,因而可能造成医源性损伤。采用DNP技术,可以直接在体内生成相应的耳廓结构,从而避免了手术带来的风险。研究人员采用小鼠作为模型,通过DNP在小鼠皮下无创打印了包含软骨细胞的耳廓形结构,该过程耗时仅20 s。在一个月后,支架结构保持良好,并且软骨细胞不断成长,形成了可用于器官重构的耳廓结构。

脂肪干细胞(ASC)具有治疗由钝器造成的闭合性组织损伤的潜力。通过DNP技术,可以在伤口处原位形成包含ASC的组织支架,有助于伤口愈合。研究人员采用带有肌肉闭合性损伤的BALB/c小鼠为模型,采用DNP技术在伤口处打印了包含ASC的组织支架,在十天后,小鼠的伤口明显愈合,并且H&E染色结果表明该支架对组织无副作用。

结论

DNP技术对于无创的体内3D生物打印的发展具有重要意义。生物墨水通过诸如注射和灌注等无创的方式递送至目标位置,其聚合和打印则通过具有良好生物穿透性的近红外照射平台实现。因其无创的特性,该方法将大大推动3D生物打印技术在临床上的应用。

 

全文链接:

https://advances.sciencemag.org/content/6/23/eaba7406

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