新加坡国立大学《AFM​》:肉眼可见!共轭低聚电解质助力革兰氏细菌的区分

按照革兰氏染色法对细菌进行分类,细菌大致可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类。其中,大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌,而大多数肠道菌都属于革兰氏阴性菌。

从分子结构上区分,革兰氏阴性菌具有不对称的外膜,外膜上有脂多糖(LPS),可作为保护细胞免受化学应激的分子筛,并且内/外膜间有一层很薄的肽聚糖。

而革兰氏阳性菌只有一层对称的磷脂膜,且有一层包裹细胞的肽聚糖,比革兰氏阴性菌厚。

虽然现在荧光显微技术荧光原位杂交(FISH)等新技术被用于细菌分类,但是相对操作复杂且需要特定地方操作,不具有随时检测能力。

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近日,新加坡国立大学的Guillermo C. Bazan和南洋理工大学的Jamie Hinks(共同通讯作者)等人联合报道了通过使用链延长的共轭低聚电解质COE-S6,可以轻松对细菌进行革兰氏分类。具体而言,利用COE-S6作荧光膜探针,可以一步就区分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。通过共聚焦显微成像、对含磷脂/脂多糖的模型膜的差示扫描量热法表明,脂多糖会阻碍COE-S6膜嵌入革兰氏阴性菌中。通过用非特异性和亲脂性膜探针FM 4-64对COE-S6进行复染色,可以对混合物中的两种革兰氏类型进行离散标记。因此,利用该单步操作过程可原位观察复杂的微生物生物膜,从而进行革兰氏分类。在嵌入COE-S6后,革兰氏阳性菌的荧光强度显着增加,用肉眼可以直接观察。此外,COE-S6不会抑制细菌生长,并且易于使用,是一种有前景的膜特异性荧光探针。

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图1、COE-S6和FM 4-64的化学结构

 

COE-S6特异性的革兰氏标记

在加入COE-S6前,作者用PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤3次收集的过夜生长的平衡期培养物。作者收集了COE-S6在450-490 nm内发射形成的荧光图像。在相同染色条件下([COE-S6]=2×10-6M),从铜绿假单胞菌检测到的放射微不足道。原位观察金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的混合培养物,进一步证明COE-S6可以选择性染色,其中仅有球菌形金黄色葡萄球菌突出COE-S6的发射。实验表明,在相同的实验条件下,COE-S6在金黄色葡萄球菌中的吸收率为65%,在铜绿假单胞菌中的吸收率为7%,说明COE-S6可用作革兰氏阳性菌的选择性原位标记染料。

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图2、评估COE-S6对革兰氏类型的标记

 

探究COE-S6特异性膜标记的位置

作者将大肠杆菌O111:B4中的脂多糖(LPS)与大型多层囊泡(LMVs)在缓冲溶液中以8: 100的重量比混合,以生成脂多糖覆盖的LMVs(LPS-LMVs),模拟革兰氏阴性菌的外膜。用2×10-6M COE-S6处理后,观察到LMVs最外膜层的清晰荧光图案。此外,共聚焦荧光显微照片发现,COE-S6结合在最外层,没有穿过内囊泡层。在两种类型中都观察到了强度相似的显着荧光信号。将LPS与磷脂(POPE和POPG)的重量比从0:100增加到20:100,进一步验证LPS对COE-S6选择性的影响。研究发现,LPS的存在会阻碍COE-S6嵌入膜中。

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图3、磷脂和脂多糖模型膜的共聚焦图

 

结合使用COE-S6和FM 4-64复染

作者利用荧光显微镜成像同时可视化两种革兰氏细菌。将等体积的具有相同光密度的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌与PBS混合,并用COE-S6(2×10-6 M)处理15 min,再用FM 4-64(1×10-6 M)处理15 min。检测发现,COE-S6存在金黄色葡萄球菌中。FM 4-64染色的两种细菌,铜绿假单胞菌的发射强度更高。此外,作者还研究了大肠杆菌K12(革兰氏阴性菌)。其中,带有金黄色葡萄球菌的COE-S6和带有大肠杆菌K12的FM 4-64都出现清晰的膜荧光,但是COE-S6无法渗透到大肠杆菌K12膜中。结果表明,COE-S6作为选择性膜标记染料在革兰氏细菌分类中具有潜在应用价值。

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图4、二元混合物的共聚焦图

 

原位生物膜革兰氏分类

作者将每种细菌以相同的接种密度接种到小孔盖玻片中,并在37 oC下孵育,制备了由粪肠球菌OG1RF和大肠杆菌UTI89组成的生物膜。在检查前,将所得的生物膜用PBS冲洗,在用4×10-6M COE-S6和2×10-6M FM 4-64的混合物染色15 min。其中,图5显示了COE-S6(绿色)和FM 4-64(红色)的发射位置。粪肠球菌优先被COE-S6染色,而大肠杆菌被FM 4-64染色。三维(3D)堆叠视图揭示了粪肠球菌和大肠杆菌的空间分布。需注意,对比荧光蛋白标记或核酸染色方法,清楚地观察到内部生物膜结构,粪肠球菌形成短链,而大肠杆菌则分散为单个细胞。将COE-S6和FM 4-64结合使用,可监控生命系统中的单个细胞类型,而不会损害细胞生存力或膜结构。

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图5、肠球菌和大肠杆菌生物膜的共聚焦显微图

 

COE-S6的光致发光(PL)光谱测量

最后,作者测量了COE-S6的PL强度,希望以此来确定革兰氏类型。对比不存在细胞或存在铜绿假单胞菌,存在金黄色葡萄球菌时,COE-S6的PL强度更大。但是添加铜绿假单胞菌后,发射强度仅略有变化。此外,在365 nm紫外线灯下,作者记录了未处理的对照、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌三组的荧光强度差异。发现金黄色葡萄球菌组的荧光最强,表明COE-S6标记可用于肉眼检测革兰氏阳性细菌。

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图6、PL光谱和直接观察

 

总之,作者提出了一种利用共轭低聚物COE-S6对革兰氏阳性菌细胞膜染色的方法。利用COE-S6可通过常规荧光计测量增强的荧光强度或肉眼直接观察紫外光激发后的荧光,进行区分革兰氏菌的类型。该方法易操作、不需要任何固定或其他预处理要求,即可简单、快速地区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

 

 

文章链接:

https://doi.org/10.1002/adfm.202004068

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