通过研究发现，过氧化氢（H2O2）是癌细胞中可自由扩散的分子之一，被认为是了解细胞生理和病理的重要细胞信号分子。其中，正常的生理的H2O2水平在产生和分解代谢之间保持平衡。然而，在癌细胞中的H2O2水平会显着增高，H2O2会从活细胞扩散到细胞膜上。因此，实时监测活细胞释放H2O2对了解肿瘤细胞间的行为和异质性具有重要意义。但是，目前定量和区分从活细胞中释放的H2O2还具有挑战性，因为它在细胞外微环境中具有快速扩散、自然分解和稀释至超低浓度的特性。虽然利用电化学、比色法和化学发光法等分析技术可以检测H2O2，但是对于生物相容性更好、制备更简单的信号探针、扩散距离更短和背景干扰更低的检测技术还需要进一步的研究。
基于此，清华大学的林金明教授和国家纳米科学中心的Lin Ling（共同通讯作者）联合报道了一种利用辣根过氧化物酶（HRP）进行功能化的液晶弹性体微球（LCEM-HRP），可以将其直接固定在细胞膜上，进而实时监测单细胞水平上H2O2的释放。LCEM-HRP可以通过同中心向径向（C-R）变形来报告H2O2，这是由于LCEM-HRP中的H2O2被HRP催化还原而引起的去质子化和LCEM-HRP中链间或链内氢键的断裂所致。其中，LCEM-HRP的变形水平显示了从细胞释放H2O2的不同量。在检测时间为10 min内，固定在细胞上的LCEM-HRP的估计检测灵敏度为〜2.2×10-7 μM。此外，研究人员还从不同构型的LCEM-HRP中探索了细胞系和细胞的异质性。总之，LCEM-HRP通过原位实时成像监测从活细胞中释放的H2O2提供了一种新方法，并且可以作为寻找用于细胞微环境中各种信号分子成像的更高级化学探针的基础。该研究成果以题为“Monitoring H2O2 on the Surface of Single Cells with Liquid Crystal Elastomer Microspheres”发布在国际著名期刊Angew. Chem. Int. Ed.上。
【图文解读】
首先，研究人员通过溶解二丙烯酸酯液晶（2-甲基-1,4-亚苯基双（4-（（（丙烯酰氧基）己基）氧基）苯甲酸酯）（RM82）、E7（LC）中的7-辛烯酸（7OAc）单体和偶氮二异丁腈（AIBN）合成了直径约2 μm和天然径向构型的LCEM。接着，利用辣根过氧化物酶（HRP）对液晶弹性体微球（LCEM）进行化学修饰形成LCEM-HRP，并将其直接固定在细胞膜上，以实时监测从单活细胞中释放的H2O2。与LCEM相似，LCEM-HRP在pH=7.4的水溶液（去离子水，DIW）和细胞培养基（MEM）中表现出径向构型。通过将荧光染料若丹明标记的HRP（HRPrhd）结合到LCEM（LCEM-HRPrhd）上，可以确定将HRP固定在LCEM上。
接着，研究人员研究了在pH=6.7下、不同H2O2浓度（0.5-5 M）的溶液，发现LCEM和LCEM-HRP都具有响应性。在此pH下，LCEM和LCEM-HRP均表现出同心构型。但是，在0.5 M的CH2O2处观察到LCEM-HRP有轻微同心向径向变形，在CH2O2>0.5 M时径向构型更加明显。在CH2O2=1.2 M处，LCEM的同心构型得以保留，而LCEM-HRP显示C-R变形。利用电子自旋共振（ESR）光谱检测了在H2O2存在下LCEM-HRP产生自由基氧物质（ROS）的情况。从H2O2+HRP和H2O2+LCEM+HRP中观察到DMPO-OH和DMPO-OOH的ESR信号，而在LCEM-HRP和H2O2的存在下，•OH信号显着淬灭。将LCEM-HRP置于pH=6.7的H2O2（1.2 M）溶液中，以评估其可逆变形。添加H2O2后，LCEM-HRP的初始同心构型变为径向构型。
然后，研究人员将LCEM或LCEM-HRP分散在细胞培养基（MEM）中，并使其固定在微通道中的细胞上。最初，LCEM-HRP在HUVEC细胞上还表现出径向构型，在A549、U87和HepG-2细胞上表现出同心构型。但是，LCEM-HRP并未保持其同心构型，在分析时间为10 min下，在A549、U87和HepG-2细胞上观察到了C-R变形。LCEM和LCEM-HRP都在HUVEC细胞上保留了其径向构型，而在初始时就在U87、A549和HepG-2细胞中观察到了快速的R-C变形。所以这种R-C变形是由于肿瘤细胞的酸性环境所导致。LCEM在肿瘤细胞上保持其同心构型，而LCEM-HRP随着时间的推移显示出反向的C-R变形。这种C-R变形是由于HRP催化从细胞释放的H2O2减少所导致。此外，由于合成代谢的改变，其他信号分子也从肿瘤细胞中释放出来，以满足细胞增殖的高生物合成需求。
研究发现，实时监测从活细胞释放的信号分子可以提高对靶向疾病以及新治疗和诊断方法的了解。因此，研究人员通过在10 min内达到100个单细胞上的LCEM-HRP构型分析了不同细胞系之间的差异性。统计分析表明，不同的细胞系释放的H2O2具有显著的差异。LCEM-HRP的形状分为从初始同心到预同心、预径向和径向四个阶段。72％的A549、14％的U87和仅2％的HepG-2细胞释放的H2O2足以带来完整的C-R变形。这些结果表明，LCEM-HRP提供了一种可靠的方法来分析从活细胞释放的H2O2，并绘制了细胞系和细胞-细胞异质性图。
【小结】
综上所述，LCEM-HRP提供了一种以单细胞分辨率下原位实时成像检测从活细胞中释放的H2O2的可靠方法。LCEM-HRP探索了不同肿瘤细胞系表面相同的细胞间的异质性。LCEM-HRP不会发生内吞作用，因此可以简单地固定在细胞膜上，具有较高的细胞相容性、较低的运行成本、超高的灵敏度以及短的分析时间（10 min）。此外，LCEM-HRP可以成为追求更先进的化学探针以监测来自活细胞的各种信号分子成像的基础。
文献链接：
Monitoring H 2 O 2 on the Surface of Single Cells with Liquid Crystal Elastomer Microspheres （Angew. Chem. Int. Ed., 2020, DOI: 10.1002/anie.202004326）
