王健君:中国科学院化学研究所 研究员
一百年前科学家“水变成冰要经过冰核”这个中间态的预言一直不能得到证实,他的团队攻克了这个百年的难题,并通过研究发现低温动物的抗冻蛋白控制冰晶生长的控冰机制。这一基础科学问题的突破,为食品、航空、医疗、生物等领域的应用提供了科学支持。当冰冻过程可控,作为超越人类极限的人体冻存技术或许可以期待。
大家可能知道冷冻保存,因为每家每户都有冰箱,冰箱就有冷冻保存的功能。但是大家可能也会很好奇,为什么这几年冷冻保存这么受关注,甚至有争议?
比如说关于卵母细胞的冻存,提出了完全不同的议案,有些人支持卵母细胞的冻存,而另外一些代表则完全反对卵母细胞的冻存;
2016年英国法院判决一个患有绝症的14岁女孩的母亲胜诉,允许这位母亲在其女儿死后将其冻存。这个判决当时引起了全世界的轰动,因为即使在今年科学界、法律界还有伦理等方面,对人体冻存都存在着争议。
我们可以看一下冷冻保存的定义,就可以明白为什么冻存这么受关注,甚至有争议。
冷冻保存就是将冷冻保存对象,如细胞、组织、器官等置于超低温的环境当中,一般是指在零下196℃的液氮环境当中,使其新陈代谢大大降低,待恢复正常的生理温度以后,这些冻存对象,细胞、组织、器官能恢复它正常的生理功能。如果将冻存对象换成人体,那就意味着几十年以后,或者几千年以后,这个人体如果能复苏的话,就能实现永生了。
这是历代的帝王、古代埃及的法老一直追求的梦想。所以大家可能能明白为什么冻存这几年这么受关注,甚至有争议。
世界上真正的第一例冻存的人体叫James bedford,他在其死后接受了冷冻保存,距今已经有五十三年了。目前世界上总共有受冻存的人体约300例,其中包括两个中国人。
现在我可以很肯定的告诉大家,所有这些冻存的人,由于技术的原因,他们是不可能复苏的。
所以也有科学家认为将人体的冷冻保存是伪科学。但是美国的一个期刊《生活科学》,它是专门报道重大的科学突破和预测未来研究方向的一个杂志,它将人体冻存技术评为:十大超越人体极限的未来科学技术之一。
研究发现环境的温度降低的时候,能大大增加器官保存时间。比如说目前的器官的保存温度是在零上4℃,它保存的时间是几个小时,长的可以达到二十来个小时。
理论研究发现,如果将器官置于零下140℃的时候,可以长期的保持。事实上,目前有些细胞,将其置于零下196℃的液氮环境当中的时候,可以实现长期的冻存。可是很遗憾的是,目前还没有冻存器官的技术。所以导致保存器官的时间很短,几个小时、长的二十来个小时,导致了大量的器官被废弃。
研究数据显示大约70%左右的,或者超过70%的心肺,由于短时间内不能找到受体而被废弃,这是非常遗憾的。因为即使在器官移植非常发达的美国,在七十个器官衰竭需要移植的人中,只有一个才能得到器官的移植。
所以在1970年,实施人类肝脏移植手术的,被称为“器官移植之父”的Thomas Starzl就预言:“只有当保存器官的技术得到突破,使器官得以保存数周、甚至数月的时候,器官移植才有可能大范围的推广。”
但很遗憾,他这个说法已经五十年过去了,现在的器官保存技术并没有很大的进步。
除了保存器官,冷冻保存还有其他很大范围的领域,比如说能挽救新冠危重患者生命的细胞疗法,当然这个细胞疗法也能治帕金森病,它的大范围的推广,必须依赖于干细胞的安全的冷冻保存;当然另外辅助生殖领域的生殖细胞的冻存,它的安全性和可靠性,也是非常关键的,因为这涉及到我们的下一代。
大家会问,为什么五十年来冻存技术没有得到突破的进展,或者它的关键的科学问题是什么呢?
其实冷冻保存有三要素:第一,当然是冻存对象:细胞、组织、器官;大家知道器官里面有超过70%的是水分,将这些水分置于零下的时候,它必然会结冰,所以这就涉及到冻存的第二要素,这些冰如果不控制的话,它必然会伤害细胞器官。
这是一组光学显微镜图片,可以看到卵母细胞在冰冻前后受到了冰晶的损害;冻存第三个要素就是要添加冷冻保护剂,使器官细胞内避免大冰晶的产生,使器官受到保护,免受冰冻的伤害。
目前大量使用的冻存保护剂是一种与盐相似的,一种跟水能发生强作用的分子。它的加入可以使器官内部在低温下面不结冰。但是要使器官内将近70%的水分,在零下140℃下面不结冰,那必须添加大量的这种有毒的盐。
有美国的科学家理论分析发现,当盐的重量比达到50—60%的时候,器官内可以实现不结冰,但是我刚才说了,这么高浓度的盐,必然对细胞有损害。
比如说目前普遍使用的冻存剂的一种,也是另外一种盐的分子,当它的浓度超过2%的时候,它会损害细胞,当然严重的时候,会改变它的一些基因。
由于这个原因,所以世界上很多的科学家都努力尝试着降低有毒的盐分子的使用。
一个方法就是可以快速地降低温度,然后升高温度。在水还没反应过来变成冰之前,已经达到了预期温度。但这个方法对细胞是适用的,因为细胞体积小、结构简单,但是对器官是不适用的,因为器官体积大、复杂。
这样快速降温、升温的时候,必然导致有个温度梯度的存在,就意味着在器官里面,有些地方温度高,有些地方温度低,当然都是零下的。相对比较温度高的地方,必然会形成大冰晶损害器官。这也是目前能冻存细胞,但是不能冻存器官的一个原因。
大家肯定会问,能不能有其他的冻存的方法避免这种有毒的盐的使用?
其实自然界确实有一些生物,它可以在酷寒下生存。比如说生活于沙漠地区的甲虫,叫小胸鳖甲;生活于极地的这种雪虱;还有生活于我国东北地区的冬尺蠖;还有阿拉斯加林蛙等等。
我2013年12月去新疆采集这种虫子,叫小胸鳖甲。当时气温是零下30℃左右,当我们把雪移开,这个虫子就跟土壤搭在一块,就像冻成一块的。但是很有意思的事情,我把虫子放在我手上几分钟以后,虫子能爬起来。这确实是非常神奇。
大家可能也会问,这些虫子体内不可能含有大量的有毒的盐。如果有的话,它没被冻死可能也被毒死了,对吧?
所以对自然界控冰体系的、生物体系的研究,必然会为我们冷冻保存提供新的思路。
确实也有很多科学家研究为什么这些虫子能在低温下生存?他们发现虫子体内主要存在的两类蛋白能控制冰晶的形成:一类叫抗冻蛋白,它能控制冰晶的生长;另一类叫冰晶核蛋白,它能控制冰晶的成核。
我得说一下冰晶的形成可以分成两步:一步是成核,一步是生长。
成核最初是一百多年前美国的科学家吉布斯提出来的。他通过简单的宏观的能量分析,提出冰晶的形成必然会经过一个形成临界冰核的阶段。如果临界冰核没有形成的话,冰晶不可能生成。
经典成核理论提出已经一百多年了,但提出的时候, 这么多年一直有争议,有些人支持这个经典成核理论,有些人则反对经典成核理论。
关键就是目前实验上没有探测到临界冰核的存在。
有三个难点:一个就是临界冰核尺寸小。尺寸小到什么地步呢?是纳米级别,相当于我们头发丝的几万分之一;另外一个临界冰核存在的时间窗口很短,瞬间的,是纳秒级别,非常快;另外一个它是随机发生的,随机意味着什么?它不可预测,没有规律。
由于以上三个难点,世界上最先进的仪器,没法捕捉到临界冰核,导致了经典成核理论是否适用于冰晶的形成,一直存在着争议。
我们根据自然界当中存在着两类蛋白,一类就是冰晶核蛋白,是目前世界上最好的冰晶成核剂;另一类是抗冻蛋白,它没有明显的促进冰核形成的效果。更有意思的事情,这两类蛋白唯一的区别就是尺寸不一样。抗冻蛋白纳米级别,冰晶核蛋白是几十纳米,两者差一个数量级。
为什么尺寸对冰核的形成如此重要?换句话说,是不是可以制备一系列的不同尺寸的这类蛋白,让它去探索这个临界冰核,是不是可以把临界冰核捕捉住?
事实上,我们通过生物工程的方法制备了一系列的蛋白,但是遗憾的是,这类蛋白大到十几纳米的时候,机械性能不好,它会产生弯曲,所以这种蛋白材料,不可能用来单变量的研究尺寸的影响,所以我们继续找,找到另一种材料叫氧化石墨烯。
氧化石墨烯就是很薄的一层片层,并且它的机械性能非常好。我们可以制备一系列尺寸氧化石墨烯。这是氧化石墨烯的电子显微镜图片,可以从3纳米、8纳米、11纳米、21纳米、50纳米等等。我们就可以用这些纳米颗粒去模拟蛋白,去研究尺寸对冰晶成核的影响。
确实实验发现氧化石墨烯纳米颗粒的尺寸,与冰晶成核过冷度的乘积是一个固定值,并且这个固定值具有普适性。它对氧化石墨烯的状态,无论是分散在水里面的,还是固定在表面的不同颗粒都适用。
这么一个普适的物理现象,必然后面有一个理论机制。
当然我们通过理论分析发现,其实氧化石墨烯上临界冰核的形成过程,与我们往杯子里面倒水的这个过程相类似。当我们往杯子里面倒水的时候,水平面与杯沿齐平的时候,水不会溢出来。我们继续倒水,水会鼓出来,这时候表面张力会把水包住。继续倒水,鼓到一定临界程度的时候,水会忽然溢出来。
临界冰核也是这种情况,它会在氧化石墨烯上形成,迅速涨到纳米颗粒的边缘。这时候由于在表面张力作用下,它不会形成冰晶,只有它继续鼓,鼓到一定程度,它会忽然瞬间的形成冰晶。进一步理论分析发现,当氧化石墨烯的颗粒,与临界冰核的尺寸相当的时候,冰晶才有可能形成。
那就意味着,我们可以用纳米颗粒,做一把尺子去量临界冰核,从而我们就证实了一百多年前吉布斯等人预测的临界冰核的存在。
接下来我们继续讲讲这个能控制冰晶生长的抗冻蛋白的控冰机制。
这是2013年我去新疆采集样品的现场照片,可以看到虫子就在雪和土壤之间。这个虫子能在酷寒下生存的重要原因之一,就是体内存在抗冻蛋白。
抗冻蛋白有两个面,就像我们手机一样,当然尺寸是纳米级别的。
最初是一个美国科学家发现了这种抗冻蛋白,所以很多科学家研究了抗冻蛋白的抗冻冰机制。但是五十多年来,关于抗冻蛋白它是喜欢冰或者不喜欢冰,一直存在争议。
我是2010年开始做这个研究的。我发现所有这些研究,它没有明确到底哪一个面喜欢冰,或者哪一个面不喜欢冰?我就想,我能不能把纳米尺度的抗冻蛋白定向固定住,然后选择性研究抗冻蛋白每一个面的亲冰或者亲水性能。
这个想法当然算不错了,示意图画的很简单,但实验操作上是非常困难的。
我的两个博士生去做这个事情,最后有个叫刘凯的硕博生,克服了两个困难,一个要把是纳米级别的,用手机定向固定是非常难的;另外一个,我定向固定还不够,还要维持蛋白的活性,花了可能六年的时间,他做到了。发现蛋白有两个面,每个面的亲冰、亲水不一样,一面亲冰,一面亲水。
为什么之前有这个争议?相当于我们有个“盲人摸象”的故事一样。
我们通过定向固定,选择性研究抗冻蛋白的性能,解决了这个争议。
解决这个争议以后,对我们理解抗冻蛋白的控冰机制有什么帮助呢?
大家看一下这个示意图:蛋白它一面亲冰,可以跟冰很好的结合;一面亲水,可以跟水很好的结合。这样就在冰水界面形成很薄的一层蛋白层面,或者分子层面的一堵墙,阻碍了水变成冰,这就是一个抗冻蛋白的控冰机制。
通过我们对自然界控冰体系的研究,我们可以看出,自然界它不是用简单地加大量的盐去保护自己,而是通过控制冰的成核,控制冰的生长。
我们算有所发现,在有所发现以后,我们也做到了有所创造,这是我们做材料的一个特色。
我们制备了一些能控制冰晶形成的冷冻保护材料。比如我们目前辅助生殖技术里面,要用大量的冻存液冻存生殖细胞,精子、卵子、还有受精卵等等。目前这些冻存液都来源于外国进口,更严重的是,这些冻存液用的是传统的方法,含有一些二甲基亚砜,刚才我说了它有毒的。用我们的这个分子冻存卵母细胞以后,它复苏率优于目前市场上二甲基亚砜含量15%的,细胞的复苏率远优于进口的二甲基亚砜含量为零的复苏率。
目前我们在东莞松山湖材料实验室的支持下,严格按照国家的标准,正在生产这些冻存试剂。当然我们也研制了一系列能用于干细胞冻存的冻存液。
比如我们用于脐带间充质干细胞冻存的材料。用我们这个材料冻存干细胞以后,它的复苏率达到了92%,优于或者远优于市场上有毒的二甲基亚砜含量为10%的冻存液。
目前我们与北医三院的眼科合作,我们希望通过我们创制的一些新的控冰材料,通过从冻存简单的组织器官入手,比如说眼角膜的冻存。
希望通过我们材料的创新,使冻存技术得到进步,当然是突破性的进步,让许多医疗技术能充分发挥它们挽救生命的能力。
这是我的一个德国合作者,他2018年去南极捕鱼,提取鱼内的抗冻蛋白。
大家知道前段时间有报道,我们一般的老百姓可以到空间站去待几天,当然这是距离比较短的。
我们知道宇宙很广袤,如果想要旅行的话,可能会花几十年算少的。我们从地球到那个地方,如果没有采取措施的话,可能生命已经结束了。
我们希望与世界上不同领域的科学家合作,使冷冻保存助力我们以后的星际旅行。