​仅15秒!《AM》超快光降解生物水凝胶支架用于类器官传代

肠类器官是有用的体外模型,用于旨在理解和治疗疾病的基础和转化研究。但是,他们的常规培养依赖于动物来源的基质,这限制了临床应用转化。当前的类器官技术几乎完全依赖于基底膜提取物,例如Matrigel。这些动物来源的基质虽然支持细胞生长,但却是蛋白质和生长因子的不明确混合物,它们在实现可再生,可扩展和可移植组织方面存在问题。因此,需要基于用于肠类器官生长和扩展的材料化学方法,开发Matrigel的替代品。实际上,很少有完全定义的合成水凝胶系统可以扩展肠类器官。

【研究成果】

最近,美国科罗拉多大学波德分校Kristi S. Anseth教授团队介绍了一种烯丙基硫醚基的可光降解水凝胶,它通过自由基加成-断裂链转移(AFCT)反应实现了快速降解,以支持肠类器官的常规传代。全文‘‘The Effect of Thiol Structure on Allyl Sufide Photodegradable Hydrogels and their Application as a Degradable Scaffold for Organoid Passaging’’发表在材料顶级期刊《Advanced Materials》上。作者首先用剪切流变学来表征硫醇和烯丙基硫醚交联结构对降解动力学的影响。

在可溶性硫醇(谷胱甘肽(GSH)15×10-3 M)和光引发剂(lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) 1×10-3 M)存在下,用365 nm光(5 mW cm-2)照射,实现水凝胶在15 s内就完全降解。烯丙基硫醚水凝胶用于支持单肠干细胞(ISCs)上皮群落的形成,快速光降解可用于干细胞群落的重复传代,而不会损失形态或类器官的形成。该平台可以支持肠类器官的长期培养,潜在地取代对动物衍生基质的需求,同时还允许系统地改变针对感兴趣的类器官的水凝胶特性。

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【图文解析】

1. 烯丙基硫醚的AFTC反应

烯丙基硫醚(AS)水凝胶,通过放大化学过程显示出在温和的光强度和光引发剂浓度下会迅速降解。具体而言,使用光引发剂在溶液中生成游离的硫自由基,这些自由基通过可逆的加成-断裂链转移(AFTC)反应裂解烯丙基硫醚交联键。烯丙基硫醚与新的巯基自由基一起再生,可以通过链转移到可溶性硫醇中引发更多的交换循环(示意图1)。

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示意图1. 光引发的自由基网络降解。

 

2. 多种交联剂水凝胶的合成及机理。

交联的水凝胶是通过与四官能聚乙二醇-二苄基环辛炔(PEG-4DBCO)和烯丙基双聚乙二醇叠氮化物(PEG3-azide)的应变促进叠氮化物炔(SPAAC)反应形成的(图1a)。这种生物正交点击反应可在溶液中生理条件下快速进行(图1b)。

内由6 wt% PEG-4DBCO(12×10-3 m DBCO)和乙酰胺(AS-AA),丙酰胺(AS-PA)和苯乙酰胺(AS-PhAA)(14.4×10-3 m叠氮化物)交联剂形成的水凝胶在<30 s达到凝胶点(储能模量和损耗模量(G’和G”)交叉),并且在600 s之前达到了的最终储能模量,在平稳期后保持不变(图1c)。接着频率扫描显示,G’和G”与频率无关,这表明在没有自由基产生的情况下具有弹性(图1d)。

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图1,AFCT基的可光降解的水凝胶的网络结构以及流变学表征。

 

3. 水凝胶降解动力学的研究

在存有可溶性硫醇的情况下,AS-PA,AS-AA和AS-PhAA裂解产物硫醇的pKa值降低(图2a)。使用配备了光固化附件的流变仪来表征交联裂解,以追踪辐照过程中(365 nm,5 mW cm-2)的G’的变化。如图2b所示,AS-PA和AS-AA实现了反向凝胶化,其中AS-PA更快,而AS-PhAA则不会(即仍然是渗透的3D网络)。

具有巯基丙酸甲酯(3MMP)的AS-PA,AS-AA和AS-PhAA凝胶的降解对应于kapp / I0×10-4的速率常数分别为310±50、190±60和70±10 cm2 mW-1 s-1(图1c)。为了确定游离硫醇质子化状态对烯丙基硫的降解影响,作者将与AS-PA交联的水凝胶与各种pKa的可溶性硫醇以及LAP进行校准并降解。

AS-PA水凝胶使用3MMP表现出快速降解,然后分别用GSH,巯基乙酸甲酯(MTG)和硫代乙酸(TAA)降解的速度越来越慢(图2d)。具有3MMP,GSH,MTG和TAA的AS-PA水凝胶的降解对应于kapp / I0×10-4的速率常数分别为310±50、240±70、130±60和56±25 cm2 mW-1 s-1(图1e)。

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图2.硫醇结构对烯丙基硫醚水凝胶降解动力学的影响。

 

4. 水凝胶生物体外研究和反复传代

由封装在合成水凝胶中的单个ISCs形成菌落是机械敏感的,并取决于水凝胶的储能模量。因此,用增加浓度的PEG大分子单体配制水凝胶,以提供增加的模量值(图5a)。观察4天后,单细胞已长成Lgr5+干细胞球形群落,其中群落形成效率(CFE)定义为成长为上皮囊肿的单细胞部分(图5b)。

群落极化形成上皮和中央管腔,这是肠类器官的关键形态特征(图5c)。由干细胞(Lgr5)和分化标志物(Lct,Lyz1,Muc2和Chga)定量实时聚合酶链反应(PCR)确定的基因表达与在干细胞诱导条件下,烯丙基硫醚化物水凝胶中生长的类器官与在Matrigel中生长的相似(图5d),这进一步表明了干细胞群落维持在可光降解的烯丙基硫醚水凝胶中。

此外,该系统可逆的实用性取决于ISC菌落反复传代的能力。封装为p1和p2的单个细胞形成群落,其效率略有下降,这可能是由于在每个传代步骤之后封装细胞密度的降低(图5e)。

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图5. 可光降解的烯丙基硫醚水凝胶支持肠类器官的膨胀和重复传代。

 

为了提高可逆性的效用,降解反应必须在存在细胞的情况下进行,而不会损害活力。免疫染色证实了溶菌酶的存在,溶菌酶是分化的Paneth细胞的标志物,Paneth细胞是肠道隐窝的关键细胞类型(图6a)。此外,5-ethynyl-2-deoxyuridine(EdU,24小时脉冲)染色仅限于隐窝(图6b)。

分别在22.5%±1.0%和27.5%±0.9%的移植类器官中发现了溶菌酶和EdU阳性的隐窝(图6c)。

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图6.烯丙基硫醚的光降解作用保持了干细胞的分化潜力。

 

【陈述总结】

烯丙基硫醚部分以前曾被用于促进交联聚合物网络中的光诱导可塑性和可逆光图案的生物分子。然而,由于缺乏对交换机理的了解,它们在调节水凝胶机械性能方面的应用受到了很大的限制。

该文作者报告了硫醇pKa作为介导烯丙基硫醚交换动力学的决定因素。通过选择呈现高pKa值的交联剂和可溶性硫醇,利用这种理解来提高降解速率。使用LPA(1×10-3 m)和5 mW cm-2的365 nm光,使用AS-PA交联剂和GSH(15×10-3 m)可以在15 s的辐照下使水凝胶完全降解。

最终,这种进步将减少光线和自由基的照射,并使较厚的样品降解。然后显示该支架仅使用RGD粘附肽即可支持单个囊状干细胞中ISC群落的扩增。快速的光降解作用允许重复传代,从而保留了肠道干细胞形成群落,以及带有隐窝绒毛区域的充分发育类器官的潜力。

该平台的使用可以替代常规类器官培养中使用的Matrigel,也可以用于研究器官发育中涉及的力学生物学过程。

原文链接:

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adma.201905366

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