3D打印技术正被运用于实现工业中的快速原位制造，以及个性化消费产品的生产。如今，先进的3D打印系统已实现将生物材料（主要是水凝胶）、生化试剂和活细胞逐层精确定位到复杂的3D功能组织中，这使得3D打印技术迈向了3D生物打印领域。3D生物打印旨在为大范围的生物医学应用复制生物组织或器官的组成、力学性能和3D结构。
当前对于临床应用而言，一般是在体外进行构件的3D打印，然后通过手术程序将其植入体内。最近报道的原位3D生物打印也仅限于外部的受损区域，例如皮肤或先前手术处暴露的部位。
然而，可注射材料用作输送载体可改善此类局限，有望以微创的方法来提高治疗功效，恢复受损的组织和器官，其中就包括基于干细胞的治疗方法。可注射水凝胶由于具备模仿天然干细胞微环境的潜力，是干细胞移植的首选材料。但是对3D形状和空间组织而言，可注射水凝胶在注射部位周围形成的各向同性的结构无法控制。
意大利帕多瓦大学Nicola Elvassore等人研发出了通过生物正交双光子环加成法，在大于850nm的波长下交联，可以在活小鼠的组织内3D打印的光敏聚合物水凝胶。这种活体内的3D生物打印不会产生副产物，并且利用常见的多光子显微镜将生物打印结构准确定位和定向到特定的解剖部位，从而可以在活体小鼠组织（包括真皮）中制造复杂的结构。
该活体3D生物打印有望成为常规生物打印的体内替代方法，使得直接在活体生物中制造三维结构和功能组织来使器官修复或重建的微创外科手术技术成为可能。该研究以题为“Intravital three-dimensional bioprinting”的论文发表在《Nature Biomedical Engineering》上。
【红外光交联策略】
该研究采用了在允许深层组织穿透的激光波长（波长> 800 nm）下使生物聚合物光交联到水凝胶中的技术。由于香豆素介导的环加成反应具有无自由基和光引发剂的化学特性，从而避免了对活体组织的潜在毒性。
因此，作者选择香豆素衍生物作为光敏交联部分，用于聚合物主链的末端官能化。当香豆素衍生物暴露于单光子紫外可见（UV-Vis）光或在近红外光的双光子激发下时，有可能发生[2 + 2]环加成反应。
但是UV-Vis波长与组织穿透力不兼容，因此作者采用了红外光交联策略来制备香豆素衍生物用作光敏交联部分的水凝胶。作者基于其光吸收性能，选择了8种香豆素衍生物进行进一步表征（图2a）。
其中，由于7-羟基香豆素-3-羧酸（HCCA）在7位具有给电子取代基和在3位具有吸电子取代基，被认为是该3D生物打印系统的最优选择。该羧基的存在使HCCA与诸如线性PEG、支链PEG和明胶等聚合物共轭（图2b），从而可用于制造生物相容性良好的水凝胶。
【双光子水凝胶制备】
作者通过使用与HCCA偶联并在宽波长范围内激发的支链PEG和明胶聚合物，测试了组装3D水凝胶的可能性。之后，通过光交联多个z向位置（图3a）或通过组合添加多个平行的线性物体（图3b，c），进一步证实了3D光交联的准确性。该研究实现了线性物体的最小线宽（1.9±0.2 µm）（图3b）和生物打印的亚微米分辨率（图3c）。作者还通过透射电子显微镜观察到HCC-PEG形成纳米组装体，证实了HCC聚合物在水溶液中可以自组装成超分子结构的设想。其中HCC光敏基团使它们紧密靠近并准备在光激发下进行快速环加成，从而在聚焦的双光子光学体系内进行有效的交联反应。这些结果证明了通过使用HCC聚合物溶液的红外光介导的光交联，能够制造具有准确3D定位、微米分辨率和可调节机械刚度的3D水凝胶。
【体内水凝胶生物打印】
皮肤被认为是无需进行额外手术即可实现3D打印的最佳目标器官。HCC聚合物溶液通过小鼠皮内注射的方式实现局部递送。作者使用双光子显微镜将HCC聚合物溶液暴露于聚焦脉冲近红外激光（λ= 850 nm）中（图4a）。然后，作者利用宿主组织的荧光，可以轻松地观察到真皮内部交联水凝胶上方的表皮完整性（图4b），其与未经处理的组织相似（图4b，c）。
此外，作者采用了外科手术的方式来暴露小鼠完整的骨骼肌，并在其上方注射了HCC聚合物溶液进行光交联。结果表明，在肌纤维表面制造3D水凝胶不会明显改变总体肌纤维形态和结缔组织完整性（图4d，e），且水凝胶仅在进行光反应的区域形成（图4f）。该实验装置能够在3D生物打印过程中进行实时成像，从而提供了在特定解剖部位触发水凝胶交联的可行性。这些结果进一步证实了该3D生物打印系统的高度生物相容性。
总结：作者证实了3D生物打印可以制造维持细胞功能的水凝胶。这种方法不仅可以预先在体外进行生物打印，还可以在活体动物不同器官中的组织上进行生物打印，并且能够做到实时成像。该活体3D生物打印有望成为常规生物打印的体内替代方法，使得直接在活体生物中制造三维结构和功能组织来使器官修复或重建的微创外科手术技术成为可能。
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