微条形码技术是一种通用技术，可为生物、医学和材料科学领域的微米和纳米级应用程序提供多重和高通量信息存储。但是，当前的荧光条形码技术主要使用光谱多路复用和荧光强度（FI）编码，它们通常容易受到编码元素的光谱重叠的影响。此外，由于样品浓度和外部微环境的可变性，很难获得定量的读数。利用荧光寿命（fluorescence lifetime），在微条形码区域能提供可重现输出。借助最新的显微成像技术，荧光寿命可以用作一种简单的技术，最大程度地降低传统荧光条形码的局限性，随着时间的推移提供可重复且定量的读数。但是，寻找能够灵活调节荧光寿命的响应材料仍然是一项持续的挑战。
研究成果
基于以上问题，来自英国伯明翰大学化学学院的Rachel K. O’Reilly教授课题组设计了一种由两种成分组成的光可切换（photo-switchable）纳米凝胶，该凝胶在通过光辐照引起的光致异构化诱导的能量转移过程中表现出可变的荧光寿命。可以使用荧光寿命成像显微镜（FLIM）直观地绘制这种远程操纵的荧光寿命特性，从而可以在微尺度上选择性地存储和显示信息。并且，在细胞器成像中，可将活细胞和亚细胞细胞器的荧光寿命成像中的背景影响降至最低。相关成果以“Manipulating the fluorescence lifetime at the sub-cellular scale via photo-switchable barcoding”为题，发表在《Nature communciation》上。
图文解析
1. 光开关纳米凝胶的设计与制备
作为一种非破坏性性刺激，光是用于无需外部接触即可进行外部操纵的重要工具之一，因此非常适合信息标记、实时标记和选择性跟踪。在这项研究中，研究者设计了一种基于光的可切换寿命条形码系统，该系统基于包含取代的马来酰亚胺（DTM）和螺吡喃（SP）开关的两组分纳米凝胶。通过诱导可逆的光异构化过程，可以通过DTM荧光基团与SP光致变色剂的开环形式之间的Förster共振能量转移（FRET）实现具有相似结构但具有多重寿命的纳米凝胶，从而实现了可控的、非可控的动态荧光寿命编码。
2. 评估光异构化过程中的能量转移和光物理行为
DTM在交联的聚合物环境中受到保护，在450-600 nm范围内发出绿色光，并具有高的荧光量子产率。相比之下，在500和600 nm之间，SP的闭环形式的吸收可忽略不计，而光致变色染料的开环形式在此波长范围内吸收，为高效FRET提供了理想方案（图2a）。时变密度泛函理论（TD-DFT）计算表明，仅当SP作为开环异构体存在时才发生FRET（图2b）。
当在大约25nm激发时，DTM的荧光发射在纳米凝胶环境中保持绿色发射（450-600 nm）。相反，在辐照同时包含DTM和SP的纳米凝胶（N2-4）时，DTM通道中的绿色发射逐渐减少，并在610 nm附近出现了一个新峰，表明FRET供体/DTM和开环的SP之间形成了一对受体（图2c）。如预期的那样，可以通过用可见光照射完全恢复DTM发射，在此期间，通过将SP切换回闭环形式来阻止FRET过程。
3. 光刺激的可逆荧光寿命
时间相关单光子计数（TCSPC）的荧光寿命成像显微镜被用作解码技术，用于可视化局部荧光寿命。首先通过监测不同发射波长下的寿命衰减来比较二维时间分辨的荧光衰减光谱。可以观察到了DTM通道中N4溶液的荧光寿命降低，由于受光刺激的FRET，开环SP的新的荧光衰减出现在600至650 nm之间。如图3a，b所示，UV照射后，N1-4中的平均寿命可以从15 ns调整到28 ns，而且与两种单体的比例线性相关。此外，通过调整到达稳定阶段之前的紫外线照射时间，可以在同一纳米凝胶中获得多个寿命（图3c，）。N4的整个寿命衰减在UV和可见光的4个循环中是完全可逆的，没有任何可测量的变化（图3d）。通过荧光寿命成像显微镜（FLIM）进一步可视化了这种可逆行为，其中可以观察到不同的寿命。
4. 活细胞中可逆的荧光寿命条形码
最后，研究者试图研究在细胞结构中的细胞内编码和解码过程。为了靶向线粒体，在通过叠氮化物反应基团官能化纳米凝胶后，通过叠氮炔环加成将TPP与纳米凝胶偶联（图4a）。通过共聚焦荧光分析，在TPP-N6的DTM通道和商用Mito Tracker的红色通道之间观察到共定位，TPP-N6的皮尔逊相关系数（PCC）为0.85，而没有TPP修饰（0.57）的纳米凝胶，表明这些材料在线粒体内的成功定位（图4b）。而且，跟踪剂基团的并入不会影响纳米凝胶系统的可逆性。与具有自发荧光效应的传统寿命条形码材料相比，这种纳米凝胶系统中荧光寿命的可逆性提供了一种策略，可通过减少信号强度来放大信噪比。
总结
在本文中，研究者开发了一种通过光致异构化诱导的FRET过程来远程控制聚合物纳米凝胶中荧光寿命。这些纳米凝胶系统进一步用于使用FLIM进行荧光寿命条形码扫描，从而达到可控、可逆和非侵入性方法跟踪并选择性地可视化荧光多态的目的。通过同时提取寿命作为读数，纳米凝胶系统能够选择性地以定量结果进行解码，从而允许以微尺度存储信息。作为概念验证，通过点击反应将线粒体追踪剂引入纳米凝胶，从而获得亚细胞规模的活细胞寿命条形码，提高了成像的灵敏度。
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